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本产品是一种高效的高产膜蛋白提取试剂盒，适用于从细胞和动物组织提取膜蛋白和胞浆蛋白，提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白，提取过程简单方便。

• 本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
  
• 本试剂盒不含有EDTA，与金属螯合层析等下游应用兼容。
  
• 本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我公司其他货号的试剂盒。也可以将最后样本除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理。

动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病发生、发展过程中扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。

• 使用方便，从样本中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 提取过程简单方便。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

离心机、移液器、振荡器、涡旋混匀器、Dounce匀浆器/匀浆机、PBS、蛋白定量试剂盒

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
  
• Western实验内参可以选用TubuLin、Na-K ATPase。
  
• 提取液A在使用前需一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
  
• 膜蛋白电泳时Loading Buffer应该避免煮沸。
  
• 膜蛋白电泳时可以提高Loading Buffer的SDS含量。

一、提取液准备
每500μL冷的蛋白提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，2μL蛋白稳定剂，混匀后置冰上备用。
每500μL膜蛋白溶解液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
注：
● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
● 提取液A在使用前需一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

二、蛋白提取

• 样品准备：
  
  • 细胞：取5～10×10⁶个以上细胞，在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    注：细胞数量根据实验调整，由于膜蛋白含量较少，需要较多细胞才能保证得率。
    
  • 组织：取适量组织样本用手术剪刀尽可能剪碎，加入冷的蛋白提取液A，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。
• 用冷PBS洗涤样品两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  
• 样品中加入200μL冷的试剂A，高速涡旋振荡5秒，置2～8℃振荡30分钟～1小时。
  注：
  ● 此步骤必须在2～8℃条件振荡。
  ● 振荡时用振荡器/摇床的较低转速，保持液体稍微晃动即可。
  ● 无2～8℃振荡条件也可不振荡，置2～8℃静置，稍微延长提取液处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  ● 提取液A处理后细胞沉淀应明显减少，否则延长处理时间。
  ● 此步如果细胞裂解不充分，下步有大量细胞沉淀，请延长2～8℃振荡裂解时间至40分钟或更长，直至细胞充分裂解。
  
• 再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，13000×g条件下离心5分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，37℃水浴10分钟，37℃条件下2000×g离心3分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层约为20～50μL。
  注：
  ● 必须37℃水浴和离心。
  ● 没有37℃离心条件可以不离心，延长水浴时间至分层明显即可。
  
• 小心收集上层，即为胞浆蛋白，下层为膜蛋白。
  注：
  ● 此时得到的膜蛋白样品即可用于下游实验。在下层膜蛋白中加入50～200μL冰冷的试剂C溶解膜蛋白，充分混匀，即可用于下游应用。
  ● 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
  ● 置4℃静置至管底透明胶状物完全溶解。
  ● 下面的第7～8步骤可以不做，如果需要进一步提高膜蛋白纯度，可以选做，但是会降低膜蛋白的回收率，损失一部分膜蛋白。
  
• 用150～200μL冰冷的试剂B稀释下层膜蛋白部分，混匀后冰浴2分钟，然后37℃水浴5～10分钟，37℃条件500～2000×g离心3分钟，此时溶液分为两层，下层约为20～50μL。
  
• 小心移除上层，用50～200μL冰冷的试剂C溶解下层，即得膜蛋白。
  注：
  ● 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
  ● 置4℃静置至管底透明胶状物完全溶解。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  膜蛋白丰度较低，需要保证足够的细胞量，在条件允许的情况下，尽可能增加细胞量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
  
• 膜蛋白电泳没有条带？
  膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
  膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可超声处理一下，再进行蛋白定量。
  蛋白加Loading Buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
  蛋白Loading Buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%～10%。
  有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
  电泳时最好采用低电压低电流电泳。
  膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。

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